14.05.2015
ото: из архива научной группы вычислительной структурной биологии МГУ ДНК-сенсор: «Тамара» оплела нанотрубку
«Святая святых клетки», «поваренная книга всего живого», «контрольная панель матушки природы», «таинственные закрома наследственной информации» — как только не называют молекулу ДНК ученые и журналисты. Научная группа вычислительной структурной биологии МГУ практикует иной подход: а давайте посмотрим на ДНК не как на священную корову, а как на обычный материал, биополимер, из которого можно сконструировать кучу полезных вещей
Аромат хорошего кофе и никаких тебе резких запахов крысиного вивария, дрозофильной среды и едких реагентов — вечных спутников биологов-экспериментаторов. Мы находимся в одной из лабораторий факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ. Длинные полки забиты наукоемкой макулатурой. Паутина проводов оплела мониторы. Начинка компьютеров привинчена прямо к стенке — для экономии места. Пестрые плакаты с графиками, таблицами, формулами иллюстрируют последние достижения местных обитателей. Между плакатами затесался огромный портрет героя телесериала «Теория большого взрыва» Шелдона Купера. С ехидной ухмылкой гениальный физик-«ботаник» наблюдает за теми, кто называет себя структурными биоинформатиками. Руководитель научной группы, 39-летний доктор химический наук и специалист по компьютерному моделированию поведения биомолекул Андрей Головин — один из них.
— Исследованием структуры нуклеиновых кислот я занимаюсь на протяжении всей моей научной карьеры, — рассказывает Головин. — В какой-то момент я сосредоточился на вычислениях, позволяющих проектировать свойства ДНК. И тут открылись сразу несколько направлений, которые, как бы пафосно это ни звучало, могут принести пользу человечеству. Хотя чего стесняться — об этом мечтает каждый ученый.
Связать белок
Взъерошенный клубок из тонких, толстых и плоских золотистых нитей на изящной подставке — это макет трехмерной структуры белка тромбина. Фермент, которому природа отвела ключевую роль в процессе свертывания крови, превращает растворенный в крови бесцветный белок фибриноген в нерастворимые волокна белка фибрина, сгустками которых организм «латает» поврежденные сосуды. Исчезни тромбин, малейшее кровотечение сулило бы нам летальный исход. Другая крайность не менее печальна. Чрезмерная активность фермента ведет к образованию внутри сосудов злокачественных сгустков — тромбов. От тромбоза вен и артерий на планете каждые 40 секунд умирает человек.
— От инфарктов, инсультов и прочих тромбозных напастей человечество спасается антикоагулянтами, препаратами, которые разжижают кровь и снижают риск тромбообразования, — рассказывает Головин. — Проблема в том, что все они в той или иной мере токсичны. Они довольно долго выводятся из организма и имеют склонность накапливаться в костных и жировых тканях. Головные боли и головокружения — только начало длинного списка их побочных эффектов. На медицинских конференциях рассказывают жуткие истории о том, как длительный прием антикоагулянтов приводил к неконтролируемым кровотечениям и все заканчивалось крайне плачевно. Как этого избежать? Над этим вопросом работает множество специалистов. Мы полагаем, с помощью разработки нового безопасного класса антикоагулянтов на основе коротких одноцепочечных молекул ДНК — или, по-научному, аптамеров.
Головин показывает модель молекулы-аптамера на мониторе. Программа имитирует нахождение молекулы в водном растворе — видно, как она трепетно подрагивает отдельными хитросплетениями своих атомов. Реальные размеры — 2 на 3 нанометра; причудливая форма, напоминающая продолговатое перекати-поле, — ее главное достоинство.
— Мы назвали ее «Тамарой». А в научных статьях, в отечественных и международных патентах она фигурирует как RA-36, или тромбаптаниб. Благодаря своей структуре наш аптамер связывается исключительно с тромбином, игнорируя другие белки. RA-36 «налипает» на поверхность тромбина в строго определенном месте по принципу «ключ-замок», изменяя структуру белка и его функциональность. Активность тромбина «замораживается»: в связанном состоянии он уже не способен участвовать в процессе тромбообразования. Но самое замечательное — RA-36 совершенно не ядовита. Спустя некоторое время она просто-напросто переваривается организмом. Специальные ферменты — нуклеазы — расщепляют ее на отдельные нуклеотиды, которые потом используются клетками для построения новых ДНК. Безотходная технология!
Времена, когда новые лекарства разрабатывались в пробирках, давно канули в лету. «Тамара» родилась в виртуальном пространстве. На другом конце университетского городка, в подвалах факультета вычислительной математики и кибернетики, в электронном мозгу суперкомпьютера «Ломоносов». Используя его вычислительную мощь, Головин и команда несколько лет подряд проектировали структуру молекулы ДНК-лекарства. С помощью мудреных методов квантовой химии и молекулярной динамики моделировали — вплоть до атомарных подробностей — взаимодействие трехмерной структуры белка тромбина с прототипами будущей RA-36. Постепенно модифицируя молекулу, добивались от нее требуемых свойств. На деле это выглядело как изучение бесконечных потоков белых цифр на черном фоне монитора — координат перемещений и взаимодействий сотен тысяч атомов. Куда уж тут без суперкомпьютера!
— Да, ковыряться в больших объемах данных — типичная работа биоинформатика, — признает Головин. — Большую часть времени мы пишем программы, которые позволяют извлечь из этих гигантских цифровых массивов некие корреляции и закономерности, отражающие необходимые дизайн, динамику и свойства проектируемых нами молекул.
Когда «Тамара» научилась надежно связывать тромбин, ее химическая формула составила уникальную последовательность из 31 нуклеотида. Молекуле пришло время материализоваться. Отдельные нуклеотиды сегодня можно купить на рынке биотеха буквально на развес — несколько сотен долларов за грамм. А специальные приборы способны синтезировать молекулярные цепочки ДНК заданной последовательности. Сразу после воплощения настал черед доклинических исследований.
Мармозетки живы!
— Мы вводили мышам двухсоткратную дозу — и хоть бы что! — восклицает Андрей Головин. — К примеру, чтобы посадить печень в ноль, достаточно принять десятикратную дозу парацетамола. А мы вводили двухсоткратную нашего аптамера! Мыши, конечно, страдали, но не померли. Оказалось, что RA-36 разжижает кровь лишь до определенного уровня, после чего эффект стабилизируется. То есть добиться летальных кровотечений с помощью ДНК-антикоагулянта вряд ли получится, даже если очень постараться.
К моменту начала испытаний на животных Головин уже зарегистрировал компанию ООО «Апта-фарма», заполучил инвестиции от фармацевтического холдинга «ФармЭко» и наладил взаимодействие с рядом крупных научных центров. До сих пор в виварии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова содержатся несколько десятков пушистых, юрких и крайне умильных созданий. Миниатюрные приматы из семейства игрунковых, мармозетки, по словам ученого, с биологической точки зрения практически не отличаются от современного человека. Особенно в том, что касается переносимости лекарств. Вслед за мышами, игрунки стали второй партией подопытных животных в серии испытаний нового препарата на токсичность.
— Не волнуйтесь, ни одна мармозетка при испытаниях не погибла. Пришлось, конечно, их немножко помучить… Они даже успели пополнить популяцию. Мы проверили, детеныши абсолютно здоровы. А что касается тестов на токсичность, то они полностью подтвердили теоретические предположения о ее отсутствии. Сейчас мы активно готовимся к клиническим испытаниям, собственно, на людях. Планируем закупать новое оборудование, позволяющее синтезировать наш препарат в количествах, близких к килограмму, чтобы хватило на «клинику», а в случае ее успешного завершения — для первых шагов на фармрынке.
Спешить у Головина есть уважительные причины. ВИЧ, гепатит С, грипп, несколько видов рака… На сегодня разработаны аптамеры к белкам, отвечающим за развитие более сотни различных недугов. Порядка пятнадцати ДНК-препаратов проходят завершающую стадию клинических испытаний в США. Три из них — прямые конкуренты RA-36.
— Стоимость синтеза нуклеиновых кислот стремительно падет: если пятнадцать лет назад за нуклеотид давали двести долларов, то теперь всего лишь двадцать рублей. При масштабировании этот процесс становится гораздо дешевле, чем синтез антител, широко используемых сейчас в терапии. Возможно, мы с вами — свидетели зарождения нового направления в фармакологии. И было бы неплохо принять в этом непосредственное участие.
— А что мешает?
— То же, что и любым другим российским ученым. Простой пример: в американскую лабораторию необходимые для экспериментов сырье и реактивы поставляют за день-два. Нам приходится их ждать месяцами. Не отлажена у нас и система грантового финансирования. Типична ситуация, когда по выигранному еще в начале года гранту деньги приходят только в декабре и приходится метаться как угорелому в попытках потратить миллион за пару недель, чтобы закрыть надвигающуюся отчетность. В остальное время заниматься наукой приходится за собственный счет. Попытки коммерциализировать свои разработки исключительно за счет грантов обречены. Хорошо еще, если есть инвестор. И совсем грустно, когда нет возможности принять на работу подающего надежды молодого ученого. В российской науке постепенно появляются деньги и интересные проекты, в нее наконец-то потянулась молодежь, а в институтах и университетах элементарно нет свободных ставок. Взять новоиспеченного кандидата наук на временную позицию — на несколько лет до завершения проекта, как это делается в любой западной лаборатории, — у нас невозможно, такое не предусмотрено законодательством. Приходится извращаться, оформлять сотрудников на четверть ставки сразу в нескольких институтах.
Бороться с огрехами системы в одиночку невозможно. Головин и не пытается. Гораздо эффективнее действовать сообща.
— Коллеги из Института нейрохирургии имени Бурденко готовы помогать нам в проведении клинических исследований. Разжижение крови пациента — стандартная процедура перед любой операцией. При сверхсложных операциях на мозге требования к антикоагулянту кратно возрастают. Теоретически RA-36 — идеальный кандидат, так как манипуляции с ним поддаются тонким настройкам: мы можем четко регулировать дозу и точно знаем время выведения из крови — пятнадцать минут. Химически модифицируя нашу молекулу, мы можем увеличить это время вплоть до полутора суток. И здесь возникает интерес специалистов из Научного центра акушерства и гинекологии имени Кулакова. Известно, что одной из причин бесплодия у женщин является повышенная свертываемость крови. Чтобы этого избежать, врачи прописывают прием изрядных доз антикоагулянта. Понятно, что вопрос токсичности препарата здесь стоит особенно остро. Не менее остро, чем при лечении детей. Поэтому мы также взаимодействуем с НИИ неотложной детской хирургии и травматологии. Леонид Михайлович Рошаль лично благословил нашу работу. Хотя идея разработки ДНК-сенсоров ему понравилась гораздо больше.
— ДНК-сенсоров?
— Ну да, сенсоров. Но об этом лучше поговорить с автором идеи.
«Тамара» на подложке
24-летний сотрудник лаборатории Артур Залевский, парень в толстовке и с ноутбуком на коленках, сидит на диванчике прямо под портретом Шелдона Купера.
— Если честно, идея не моя, — немного смущается он. — Я вычитал ее в статье корейских ученых. Суть в следующем: взять аптамер и прикрепить его одним концом к углеродной нанотрубке. В принципе это все. Наличие рядом с такой системой белка, с которым будет стремиться связаться данный аптамер, вызовет изменение сопротивления нанотрубки, что легко зафиксировать. По изменению сопротивления рассчитываем концентрацию белка, а значит — детектируем то или иное заболевание. При помощи суперкомпьютерного моделирования мы разобрались в тонкостях процесса и совместно с Центром «Зондовая микроскопия и нанотехнология» МИЭТа разработали прототип сенсора для детекции вирусов гепатитов В и С.
Правда, функционируют образцы пока что так себе: эффективно работает только каждый второй, признается чуть позже Артур. Но захватывающие перспективы мотивируют довести технологию до ума:
— Представьте, что вам больше не нужно будет стоять в очереди, платить кучу денег за болезненные анализы и ждать результатов несколько дней. Достаточно будет всего одной капли крови и нескольких секунд — и крошечный сенсор выдаст вам результаты комплексного анализа. Для работников экстренных служб подобное устройство — вещь незаменимая. А ребята из Центра «Зондовая микроскопия и нанотехнология» придумали, как создать подложку сенсора из биосовместимых материалов. Такой ДНК-чип можно вживить в организм, и он будет отслеживать состояние здоровья в режиме онлайн. Скажем, периодически отправлять вам на смартфон подробные отчеты, предупреждать о возникновении и развитии болезней, советовать, какие превентивные меры принять. Круто, да?
ДНК-дизайнер
Проблемы, занимающие дипломницу Андрея Головина, четверокурсницу факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ Анастасию Столярову, еще круче.
— ДНКашечка — она же вся из себя инженерная, проектируемая, — говорит симпатичная хрупкая девушка. — Из нее можно конструировать совершенно удивительные штуки.
Например, оранжевый смайлик, который красовался на обложке мартовского номера журнала Nature за 2006 год. Улыбающаяся рожица попала на страницы авторитетнейшего научного издания не только благодаря чувству юмора редакторов: смайлик диаметром 100 нанометров был собран исключительно из молекул ДНК. Автор публикации, молодой кандидат наук из Калифорнийского политеха Пол Ротмунд этим не ограничился, представив на суд ученой общественности еще и снежинки, цветочки, звездочки и даже карту обеих Америк в масштабе 1:200 000 000 000. Попутно Ротмунд описал технологию, позволяющую сплетать из нитей ДНК произвольные плоские фигуры, и назвал ее «ДНК-оригами». Через несколько лет ученые конструировали уже трехмерные структуры. Высший пилотаж ДНК-оригамистов — создание «нанороботов для молекулярного транспорта». Это разнообразной формы контейнеры размером в десятки нанометров с подвижными крышками, запирающимися на еще более миниатюрные ДНК-замки. Путешествуя по системе кровообращения живого организма, они способны переносить внутри себя отдельные молекулы — например, ядовитого, но эффективного лекарства. При встрече с вирусами, раковыми клетками или другими патологическими образованиями (в зависимости от того, у какой «мишени» «замок» запрограммирован раскрыться) контейнеры выгружают свое содержимое. Тем самым достигается сверхточная доставка активных веществ и исключается возможность поражения здоровых тканей. Специалисты из Гарварда уже тестируют похожие нанокапсулы на животных.
— Технология сборки структурных элементов подобных устройств во всех случаях примерно одинакова, — переходит на серьезный тон Анастасия. — Каркасом служит длинная одноцепочечная нить ДНК, которая «упаковывается» в необходимую форму, благодаря «стяжкам» — коротким молекулам ДНК. При этом главная задача ДНК-оригамеров — суметь рассчитать необходимые последовательности длинных и коротких ДНКашек таким образом, чтобы после синтеза их можно было сгрудить в одну пробирку, где бы они уже сами собрались в нужные структуры. Усовершенствованием алгоритмов таких расчетов я занималась раньше. А теперь меня интересует создание простого и надежного способа контроля качества сборки структур из ДНК. Ведь не всегда молекулы собираются правильно, процент брака зависит от множества факторов.
Возможно, в те скорые времена, когда ДНК-роботы будут чинить наши организмы, Анастасия Столярова станет известным ученым и будет читать студентам лекции по теме «ДНК-дизайн и инжиниринг». Возможно. Если, конечно, наши чиновники успеют решить проблемы с доставкой реактивов и выплатой грантов, а в университеты и НИИ позволят без ухищрений брать на работу перспективных сотрудников.
Что такое ДНК
Самый надежный носитель информации
В широком диапазоне внешних условий структура ДНК проявляет завидную стабильность — если, конечно, вам не вздумается прокипятить ее в 80-градусном абсенте. Ученые умудряются извлекать молекулы ДНК даже из клеток доисторических животных, обитавших более семисот тысяч лет назад. А ведь ДНК примерно в 3,5 тысячи раз тоньше человеческого волоса — всего два нанометра. Ну а длина зависит от того, какому организму она принадлежит. ДНК простейших вирусов содержит всего несколько тысяч нуклеотидов, бактерий — несколько миллионов, а высших организмов — миллиарды. Если сшить друг за дружкой все молекулы ДНК, содержащиеся лишь в одной клетке человека, получится нить длиной около двух метров.
Главная молекула живой природы устроена изящно и просто: пара «слипшихся» полимерных цепочек, завитых в двойную спираль. Каждая цепочка состоит из четырех типов звеньев — нуклеотидов — аденина (А), гуанина (Г), тимина (Т) и цитозина (Ц). Звенья скреплены между собою мощными ковалентными силами, а липнут цепочки друг к другу благодаря слабым водородным связям (настолько слабым, что они начинают рваться при температуре выше 50 градусов). Причем липнут не абы как: аденин одной цепи всегда клеится к тимину другой (А-Т), гуанин же связывается исключительно с цитозином (Г-Ц).
В последовательности нуклеотидов и заключена заветная генетическая информация. Гены кодируют синтез белков — тоже полимерных молекул, только устроенных на порядок сложнее. Вместо четырех нуклеотидов разнообразие белков в природе определяется двадцатью типами аминокислотных остатков. Друг за другом, как бусины на нитке, аминокислоты соединены в ожерелья, закрученные в пространстве в клубкообразные структуры. Основных функций у белков всего две: быть главным строительным материалом всего живого и регулировать биопроцессы в клетке и в организме в целом.
Даниил Ильченко, при участии Анны Малик, Ирины Гончуковой, Марии Старченковой